مشخصات پژوهش

عنوان	کلونینگ و تولید نوترکیب آنزیم گرانزیمM انسانی
نوع پژوهش	مقاله چاپ شده
کلیدواژه‌ها	گرانزیمM، آپوپتوز، کازئین، فعالیت پروتئازی، انکلوژن بادی
چکیده	زمینه و هدف: گرانزیمM یکی از اعضای خانواده ی سرین پروتئازهاست که درلنفوسیت های T سیتوتوکسیک و سلول های NK بیان می شود. گرانزیمM یک القاکننده ی آپوپتوز در سلول های توموری هدف می باشد. در این مطالعه ناقل بیانی حاوی cDNA گرانزیمM ساخته شد، سپس پروتئین گرانزیمM بیان گردیده و بطور همزمان طی خالص سازی تاخورد. در نهایت آنزیم فعال تولید شده و فعالیت آن با سوبسترای کازئین ارزیابی شد. روش بررسی: قطعهcDNA مربوط به گرانزیمM فعال به درون ناقل بیانی pET21a(+) کلون و ناقل نوترکیب جهت بیان پروتئین، به سلول های مستعد با روش شوک حرارتی منتقل گردید. جهت بیان بالای پروتئین، شرایط القا بهینه گردید و سپس آنالیز پروتئین توسط SDS-PAGE انجام گرفت. سپس انکلوژن بادی های تولیدی در بافر حاوی اوره 8 مولار حل شده و با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل-آگارز خالص شد. فعالیت پروتئازی گرانزیمM با استفاده از سوبسترای کازئین و با روش اسپکتروفتومتری (طیف سنجی) سنجیده شد. یافته ها: گرانزیمM نوترکیب در باکتری E. coli به صورت انکلوژن بادی تولید شد و بهترین سطح بیان در دمای 22 درجه با غلظت 1 میلی مولار از IPTG در طول 5 ساعت است. با استفاده از ستون نیکل- آگارز و شیب غلظت اوره، گرانزیمM به طور همزمان با تاخوردن، خالص گردید. نتایج حاصل از تعیین فعالیت نشان داد که آنزیم در حضور سوبسترای کازئین فعال بوده و فعالیت ویژه اش 71 واحد بر میلی گرم است. فعال بودن گرانزیمM نشان دهنده این بود که آنزیم تاخوردگی درستی پیدا کرده است. نتیجه گیری: نتایج نشان داد روش مورد استفاده برای تاخوردن گرانزیمM موفق بوده و آنزیم تاخورده فعال است بطوریکه می تواند کازئین (سوبسترا) را تخریب نماید. بدین ترتیب در این تحقیق روشی آسان در جهت تولید گرانزیمM و بررسی فعالیت این آنزیم که در آپوپتوز سلولهای سرطانی دخیل است، پیشنهاد شد. با توجه با اینکه گرانزیمM می تواند هدفی بالقوه برای داروهای ضد سرطان باشد، بنابراین روش پیشنهادی در این تحقیق می تواند تسهیل کننده مطالعه بیشتر بر روی این آنزیم باشد.
پژوهشگران	نرگس خازه (نفر اول)، محمد پاژنگ (نفر دوم)، فرامرز مهرنژاد (نفر سوم)، نادر چاپارزاده (نفر چهارم)